本发明公开了一种筛查结直肠腺瘤的试剂盒。本发明提供的一种筛查或辅助筛查结直肠腺瘤的试剂盒,包括用于检测磷脂含量的装置和由所述磷脂含量建立的比对卡;所述磷脂为16:0SM、18:0SM、14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:4LPC、20:0LPC、22:6LPC和22:0LPC。本发明以饱和LPC、20:4LPC和SM为标志物,建立了区分健康对照和结直肠腺瘤患者的分子模型,该模型判别结直肠腺瘤的灵敏度和特异度分别为89%和80%。
1.一种筛查或辅助筛查结直肠腺瘤的试剂盒,包括用于检测磷脂含量的装置和由所述磷脂含量建立的比对卡;所述磷脂为16:0SM、18:0SM、14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:4LPC、20:0LPC、22:6LPC和22:0LPC。
2.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于:所述由磷脂含量建立的比对卡上设置有直线、横坐标和纵坐标;所述直线为0.0093×饱和LPC总量–1225×20:4LPC%+0.02×SM总量=
3.3;所述横坐标为0.0093×饱和LPC总量–1225×20:4LPC%;所述纵坐标为SM总量;所述20:4LPC%为所述20:4LPC含量占不饱和LPC总量的百分比。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于:所述SM总量为所述16:0SM和所述18:0SM含量的总和;所述饱和LPC总量为所述14:0LPC、所述16:0LPC、所述18:0LPC、所述20:0LPC和所述22:0LPC含量的总和;所述不饱和LPC总量为所述18:2LPC、所述18:1LPC、所述20:4LPC和所述22:6LPC含量的总和。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒,其特征在于:所述用于检测磷脂含量的装置为液质联用仪。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒,其特征在于:所述检测采用的流动相为体积比为90:10:0.1的甲醇、水、氨水混合物;所述磷脂含量为离体血浆中磷脂含量。
6.根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒由所述用于检测磷脂含量的装置和所述由所述磷脂含量建立的比对卡组成。
7.权利要求1-6中所述的试剂盒在制备鉴定、辅助鉴定、筛查或辅助筛查结直肠腺瘤的产品中的应用。技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种筛查结直肠腺瘤的试剂盒。
背景技术
结直肠腺瘤(CRA)是一种具有癌变潜能的良性病变,是结直肠息肉的一种。结直肠息肉是指高出于黏膜、突向肠腔的赘生物,可以有蒂,也可以为广基无蒂。临床诊断的结直肠息肉在病理学上包括肿瘤性息肉和非肿瘤性息肉,而结直肠腺瘤则属于肿瘤性息肉。根据WHO关于结直肠癌定义的新阐述,结直肠腺瘤也可称为结直肠上皮内瘤变,指结直肠黏膜上皮具有组织结构和细胞学上的异型性,但这种改变未突破黏膜肌层,一旦突破黏膜肌进入黏膜下层,则为结直肠癌(CRC)。临床上大多数结直肠癌(>80%)来自结直肠腺瘤性息肉恶变。结直肠腺瘤作为结直肠癌(CRC)的癌前病变已被普遍认同,这种结直肠癌进程中的腺瘤-癌序贯学说被广泛接受。文献报道在一些结直肠腺瘤发病率较高的国家结直肠癌发病率也较高,及时发现结直肠腺瘤并加以摘除可使结直肠癌的发生率降低85%。另一些文献报道,全面筛查并切除5mm以上腺瘤的人群,其结直肠癌(CRC)发病率降低76%-90%。因此,正确诊断并处理结直肠腺瘤具有重要的临床意义。结直肠腺瘤在临床上的常用筛查方法有:1粪便潜血检查,诊断CRC和息肉的敏感性为37.1%~79.4%,特异性为87.5%;2粪便免疫化学检查,诊断CRA的敏感性是94.1%,特异性是87.5%;3粪便DNA测定,该技术是检查粪便中腺瘤和CRC脱落细胞的DNA。现有试剂盒可以检测20多种变异的DNA,如K-ras等。但没有一种单独的基因变异出现在所有的腺瘤和CRC中,所以商品化的试剂盒并不能诊断全部腺瘤和CRC。4乙状结肠镜检查,最简便,但检查不全面,较少应用;5大肠镜检查,目前应用最多,但肠镜并非完美无缺,>10mm腺瘤漏诊率可达6%-12%,结直肠癌漏诊率约5%;6双重气钡造影,可检查全部结直肠,诊断CRA敏感性为85%-97%。7CT结肠断层造影(CTC),检出>6mm腺瘤的敏感性是89%,而老年人(70岁以上)因年龄增大对放射性的敏感性会降低。磷脂不仅是构成生物膜的重要成分,一些磷脂分子本身或者其代谢产物还是作为重要的信号分子,其中溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC)、神经鞘氨醇磷酸胆碱(sphingosylphosphorylcholine,SPC)、溶血磷脂酸(lysophosphatidicxa0acid,LPA)、鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)和鞘磷脂(sphingomyelin,SM)等可以通过其自身或代谢产物与细胞表面的受体结合,激活下游信号通路,参与细胞增殖、迁移、形态发生和吸附在内的多种生命活动的调控。这些脂类分子及其代谢产物与多种生理和病理进程息息相关。例如SPC和SM均可以转化为S1P,而LPC通过ATX催化可以生成LPA,S1P和LPA作为功能活性脂类分子对肿瘤发生的调节功能十分显著。随着生物活性脂类分子与肿瘤相关性认识的深入和脂类分子检测手段的进步,一些生物活性脂类分子被认为可能作为肿瘤早期诊断的生物标记物。鉴于生物活性磷脂分子的重要生理和病理意义,本发明利用质谱技术检测了正常人和结直肠腺瘤病人血浆中一系列生物活性磷脂分子的含量,建立了基于脂类组学的结直肠腺瘤筛查技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定、辅助鉴定、筛查或辅助筛查结直肠腺瘤的试剂盒。本发明提供的试剂盒,包括用于检测磷脂含量的装置和由所述磷脂含量建立的比对卡;所述磷脂为16:0SM、18:0SM、14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:4LPC、20:0LPC、22:6LPC和22:0LPC。上述试剂盒中,所述由磷脂含量建立的比对卡上设置有直线、横坐标和纵坐标;所述直线为0.0093×饱和LPC总量–1225×20:4LPC%+0.02×SM总量=3.3;所述横坐标为0.0093×饱和LPC总量–1225×20:4LPC%;所述纵坐标为SM总量;所述20:4LPC%为所述20:4LPC含量占不饱和LPC总量的百分比。上述由磷脂含量建立的比对卡也可以认为由直线、横坐标和纵坐标组成;上述试剂盒中,所述SM总量为所述16:0SM和所述18:0SM含量的总和;所述饱和LPC总量为所述14:0LPC、所述16:0LPC、所述18:0LPC、所述20:0LPC和所述22:0LPC含量的总和;所述不饱和LPC总量为所述18:2LPC、所述18:1LPC、所述20:4LPC和所述22:6LPC含量的总和。上述试剂盒中,所述用于检测磷脂含量的装置为液质联用仪。上述试剂盒中,所述检测采用的流动相为体积比为90:10:0.1的甲醇、水、氨水混合物;所述磷脂含量为离体血浆中磷脂含量。上述试剂盒中,所述试剂盒由所述用于检测磷脂含量的装置和所述由所述磷脂含量建立的比对卡组成。上述的试剂盒在制备鉴定、辅助鉴定、筛查或辅助筛查结直肠腺瘤的产品中的应用也是本发明保护的范围。本发明的实验证明,一系列含有胆碱基团的磷脂分子可以作为区分健康人群和结直肠腺瘤患者的分子标志物,例如LPCs、16:0SM和18:0SM。利用饱和LPC、20:4LPC、16:0SM和18:0SM为标志物建立分子模型,可以区分健康对照和结直肠腺瘤患者,灵敏度和特异度分别达到89%和80%。
附图说明
图1为饱和LPC、不饱和LPC、总LPC以及总SM(16:0SM+18:0SM)含量在健康对照组和结直肠腺瘤患者血浆中的含量变化图2为利用LPC和(16:0,18:0)SM区分中国人群中健康对照与结直肠腺瘤患者的模型
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。实施例1、筛查结直肠腺瘤的试剂盒的构建一、分子模型的建立1、血液收集、脂类分子提取和检测1)研究对象所有样本收集于2007年5月-2010年5月,样品来自全军第二炮兵总医院、北京医院、北京大学第二附属医院。早晨取空腹病人血液进行预处理。此项目经过Institutionalxa0Reviewxa0Board审批,所有受试者签署知情同意书。表1概括了研究对象的基本情况:240个受试者均为中国人,65.4%为男性(157/240),男性在健康对照与腺瘤患者中占的比例分别为68%和63%。健康对照、腺瘤患者的年龄分别为:55.2+7.5、54.5+14.2,取样年龄没有显著性差异。表1研究对象的基本情况 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 2)血浆样本制备、脂类分子提取和检测在含有EDTA的管中收集上述1)的样本的离体全血,室温(25°C)1,750g离心15分钟,将离体血浆分装入硅化处理的管子,-80度冰箱保存,避免反复冻融。LPC、SPC和SM的提取:向玻璃离心管中加入0.5mlxa0PBS(Hyclone公司,SH30256.01B),加入100μlxa012:0LPC(avantixa0polarxa0lipidsxa0855475P,100mM),加入3ml甲醇/氯仿(体积比为2:1)。向上述溶液中加入10μl上述得到的离体血浆,漩涡混匀后冰上放置10分钟。加入1ml氯仿,1.3ml蒸馏水,混匀,室温(25°C)1,750g离心10分钟,取下层有机相,氮气吹干,用1ml甲醇/水(9:1)溶解,取200μl上机检测LPC、SPC和SM及各亚类含量。上述上机检测均采用质谱检测系统为:Appliedxa0Biosystemsxa0Sciexxa03200xa0QtrapTMmassspectrometer,Appliedxa0Biosystemsxa0Sciex,Ontario,Canada。流动相为:甲醇/水/氨水(90:10:0.1),所述检测磷脂含量流动相的流速为0.2ml/min。一系列磷脂的标准品均购自Avantixa0Polarxa0Lipids公司,部分产品的产品目录号如下表2所示:表2脂类的标准品 xa0xa0Name
xa0xa0Cataloguexa0N0.
xa0xa012:0LPC
xa0xa0855475P
xa0xa014:0LPC
xa0xa0855575P
xa0xa016:0LPC
xa0xa0855675P
xa0xa018:2LPC
xa0xa0790648P
xa0xa018:1LPC
xa0xa0845875C
xa0xa018:0LPC
xa0xa0855775C
xa0xa020:0LPC
xa0xa0855777C
xa0xa020:4LPC
xa0xa0由该公司合成
xa0xa022:0LPC
xa0xa0855779C
xa0xa022:6LPC
xa0xa0由该公司合成
xa0xa0SPC
xa0xa0860600P
xa0xa0lyso-PAF
xa0xa0878119C
xa0xa014:0LPA
xa0xa0857120X
xa0xa016:0LPA
xa0xa0857123P
xa0xa018:1LPA
xa0xa0857130C
xa0xa018:0LPA
xa0xa0857128X
xa0xa0S1P
xa0xa0860492P
xa0xa016:0SM
xa0xa0860061C
xa0xa018:0SM
xa0xa0860062C
2、实验结果1)性别对血浆中磷脂含量的影响由于在全部240个样本中男性比例较高(65.4%),我们对血浆中磷脂分子的含量(μM)与性别之间的关系进行了检测。检测结果如表3所示,如果将p=0.01作为标准进行t检验,所有血浆中被检测的磷脂分子的含量在男性和女性之间均没有显著差异。表3血浆中磷脂含量的性别差异 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="647"/> 2)健康对照和结直肠腺瘤患者血浆中磷脂分子含量的测定检测了全部240个样本中以下磷脂分子及其亚类的含量(μM):SPC、lyso-PAF、14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:4LPC、20:0LPC、22:6LPC、22:0LPC、16:0SM和18:0SM。结果如图1和表4所示,与健康对照组相比,绝大多数的LPC亚型,包括14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:0LPC、22:6LPC和22:0LPC,在结直肠腺瘤患者血浆中的含量都显著降低,但是22:4LPC的含量在结直肠腺瘤患者血浆中升高。饱和LPC、不饱和LPC和总LPC含量在结直肠腺瘤患者血浆中都显著下降。此外,16:0SM、18:0SM和总SM含量在结直肠腺瘤患者血浆中也都显著下降(表4,图1)。表4健康对照和结直肠腺瘤患者血浆中磷脂分子的含量 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="644"/> 3、建立区分健康对照和结直肠腺瘤患者的模型基于上述磷脂分子在不同检测组别中的差异,建立区分健康对照和结直肠腺瘤患者的分子模型:由于结直肠腺瘤患者血浆内16:0SM和18:0SM的含量都显著下降(图1),因此SM将成为区分腺瘤和正常对照或腺瘤和肿瘤患者的重要指标。模型的公式:[0.0093×饱和LPC总量–1225×20:4LPC%+0.02×SM总量=3.3]SM总量为16:0SM和18:0SM含量的总和;饱和LPC总量为14:0LPC、16:0LPC、18:0LPC、20:0LPC和22:0LPC含量的总和;20:4LPC%为20:4LPC含量占不饱和LPC总量的百分比。不饱和LPC总量为18:2LPC、18:1LPC、20:4LPC和22:6LPC含量的总和。二、筛查结直肠腺瘤试剂盒的构建1)建立比对卡比对卡由模型的公式(直线)、横坐标和纵坐标组成;横坐标为0.0093×饱和LPC总量–1225×20:4LPC%;纵坐标为SM总量;2)试剂盒的构建试剂盒包括比对卡和液质联用仪Appliedxa0Biosystemsxa0Sciexxa03200QtrapTMxa0massspectrometer,Appliedxa0Biosystemsxa0Sciex,Ontario,Canada。实施例2、筛查结直肠腺瘤的试剂盒的应用1、筛查结直肠腺瘤的试剂盒的灵敏性和特异性检测取120个结直肠腺瘤(均经过临床鉴定)和120例结直肠肿瘤患者(均经过临床鉴定确诊)的血液;按照实施例1的一的1的2)的方法进行离体血浆制备、脂类提取、液质联用仪检测,得到16:0SM、18:0SM、14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:4LPC、20:0LPC、22:6LPC和22:0LPC含量;以0.0093×饱和LPC总量–1225×20:4LPC%为横坐标,以SM总量为纵坐标,以模型的公式[0.0093×饱和LPC总量–1225×20:4LPC%+0.02×SM总量=3.3]作直线,进行作图。结果如图2的右图所示,为每个腺瘤患者(a)和健康对照(h)的血浆中(0.0093×饱和LPC总量-1225×20:4LPC%)对SM总量作图。图中直线为:[0.0093×饱和LPC总量–1225×20:4LPC%+0.02×SM总量=3.3]。直线左侧被判定是腺瘤患者,右侧判定为健康。共计120个健康对照和120个结直肠腺瘤患者。公式中的20:4LPC%范围为0-100%,代表20:4LPC含量占所有不饱和LPC总量的百分比。经分析,共有134个样本在直线左侧,其中107样本来源于结直肠腺瘤患者(120),而27个样本来源于健康对照(120);120个结直肠癌患者中的107个患者被正确诊断(在直线的左侧,并且经过肠镜检测确诊)。因此,该模型的灵敏度为89%(腺瘤患者中被诊断出来的个数107/腺瘤患者总数120=89%)和特异度为80%(被诊断为腺瘤患者中实际腺瘤患者的数目107/被诊断为腺瘤患者的数目134=80%)。图2的左图为由右图建立的区分结健康对照和结直肠腺瘤患者的ROC曲线。如果将该模型的灵敏度设定在85%,特异度可以升为82%。利用这个公式,120个腺瘤患者中18个患者被误诊为健康,22个健康对照被误诊为腺瘤患者。即,以LPC和SM为标志物可以建立区分中国人群中健康对照和结直肠腺瘤患者的模型,该模型具有良好的灵敏性和特异性。